2024年2月11日日曜日

スーパー初心者のためのオリゴ核酸合成入門:再考ホスホロアミダイト法

プレ・コロナの時代に池袋の美久仁小路にある昼は定食屋、夜は居酒屋なお店に行ったときのメモです。

-ずぼらmemo-
住所:豊島区東池袋1-23-11 美久仁小路 小野ビル1F 

-焼魚定:鯖 (800-discount 50=750 JPY, visited Apr. 2019)- 
-RATING- ★★★★★
-REVIEW-
ごはん・味噌汁・小鉢・おしんこ(小)付。 
水金曜日は定食50円引き。 
鯖は嫌味なところが全く、マイルドなフィッシーノート(fishy note)は綺麗でさえあり、最高に食欲を掻き立てられる。
身はフカフカ、ホクホクな膨らみのある食感でとってもジューシー。塩味は控えめで、軽やかな脂の旨さと、上品で力強い鯖の香味がふんだん。 
脇に添えられている大根おろしに醤油を少し落として鯖の身に載せ、ご飯と一緒に掻きこむのが至福。 
味噌汁は、しじみ、豆腐、わかめから選択できて、今回は蜆をセレクト。
底に沢山の蜆が沈んでいて、その風味がとっても濃厚。 
いんげんの胡麻和え(小鉢)は軟らかく、優しい味付け(筋が少しあるのはご愛嬌)。 


-ビール (瓶) キリン(大) (600 JPY+tax, vsited Jun. 2019)-
ラガー。 

-お通し (多分300 JPY+tax, visited Jun. 2019)-
-RATING- ★★★★★
-REVIEW-
酢の物。 
オクラとモズクがとってもフレッシュ! 
山芋の千切りも入ってる。 
お酢の風味の円やかさが絶妙。 




-煮込み (400 JPY+tax, visited Jun. 2019)-
-RATING- ★★★★★
-REVIEW- 
味噌仕立ての煮込みで、王者の風格漂う味わい。 
モツは味が染みていて軟らかく、スナックライクな食感もあって絶妙な食べ心地。 
お豆腐は絹と木綿が混在しているような感じ。 
お味噌仕立てのツユは五臓六腑に染み渡る旨さ。
丁度いい塩梅の味付けで、味噌汁的ニュアンスを感じました。 


-桜えびかき揚げ (400 JPY+tax, visited Jun. 2019)-
-RATING- ★★★★★
-REVIEW-
衣は軽やかで、桜えびは滋味深い香味でフレッシュ。 
何も付けずに食べると、口の中で甘味が拡散する。
マイルドな味の粗塩を振って食べると、キュッと味が締まる。 
シャクッとした玉葱とクニッとした桜えびの食感の融合が心地いい。 
ビールによく合います。

このお店は昭和29年(1954年)創業で、美久仁小路の最古参らしいです。


閑話休題


やっぱり流行ってそーだぜー、オリゴ(デオキシ)ヌクレオチド。
その合成法は定番のホスホロアミダイト法で、以前簡単にメモしました↓

富士フイルム和光純薬のウェブサイト(和光純薬時報)でも、佐藤健太郎さんが解説記事を書いています↓

佐藤さんの記事はとても分かり易くためになる記事なのですが、ボクなりに多少視点を変えてメモしてみました。

ハイ、ホスホロアミダイト法 の合成サイクルを示す定番の画です↓


A:活性化とカップリング、B:キャッピング、C:酸化、D:脱トリチル化のサイクルを繰り返し、望みの鎖長に達したら、E:樹脂からの切り出しとリン酸基と核酸塩基の保護基を脱保護(脱固相担体・脱保護)することで目的のオリゴ核酸(VI)を取得します。
それでは、サイクルに各工程について見ていきましょう。

まず、「A:活性化とカップリング」のステップです。

固相担体に結合した(オリゴ)核酸とヌクレオシドホスホロアミダイトとの反応です。
まず、ホスホロアミダイトがプロトン化され、次いでテトラゾールがジイソプロピルアミノ基と置換します。その後、5'-位の水酸基と反応するわけですが、5'-水酸基のプロトン化されたホスホロアミダイトへのダイレクトアタックのメカニズムも考えられます。
あと、ヌクレオシドホスホロアミダイトはプロトン化することで活性化(不安定化)するので、一般論として乾燥個体の状態で保管しておけばかなり安定です。

あと、活性化剤の酸性でホスホロアミダイトモノマーの脱トリチルが起こってしまい、その結果n+1の不純物を副生する懸念があることから、強すぎない酸性と良好な溶解性に加えて高い求核性を有するDCIが教科書的には推奨されています。だけど、活性化剤の選択にはプロセス最適性とか好みとかもあるんじゃないかと思います。


因みに、試薬グレード(TCI)だと、
1H-tetrazoke:24,600 JPY / 25 g
ETT:9,900 JPY / 5 g
BTT:15,000 JPY / 25 g
DCI:13,300 JPY / 25 g, 68,400 JPY / 250 g
ですね。


次に「B:キャッピング」工程です。


NMI、無水酢酸、ピリジンのアセトニリル溶液でキャップ化を行うと思うんですが、もっぱらNMIが未反応の5'-水酸基のアセチル化を触媒し、ピリジンは脱トリチル化を抑制する働きをします。
基本的なことなんですが何故キャップ化を行うかというと、通常n-1の不純物が最も分離し難いわけで、毎サイクルキャップ化することで(n-1)-merの副生を抑制できるから重要なんですね。


次に続くは「C:酸化」です。

カップリング工程で生成する亜リン酸トリエステル(P(III))は酸に対して不安定で、酸にさらされる前に安定なP(V)に変換しなければなりません。
なので、酸を使う脱トリチル化の前に酸化(P(III)→P(V))を終えておく必要があります。
あと、脱トリチル化後に酸化を持ってくると、5'-水酸基が酸化される懸念もゼロではないかもと思いました。


酸化が終わったら、次のサイクル(カップリング)に向けた「D:脱トリチル化」です。


ジメトキシトリチルカチオンは鮮やかなオレンジ色なので、自動合成装置に組み込まれているUV検出器でモニターすることで、しっかり脱保護することができます。


A、B、C、Dのサイクルを繰り返して望みの鎖長まで伸長させたら、最後は「E:脱固相担体・脱保護」です。
樹脂を伴ったスクシンユニット、リン酸基の保護基であるシアノエチル基、核酸塩基の保護基を切断します。
オリゴDNAの反応では濃アンモニア水を55˚Cで作用させるのがスタンダード。脱樹脂とシアノエチル基の脱保護が核酸塩基の脱保護に先んじて起こります。
上の画では、核酸塩基の保護基の脱保護が55℃ではじめて起こるかのように描いてありますが、これは程度の問題で核酸塩基の保護基は室温で全く起こらないといわけではなくて、室温でも長時間反応させればかなり外れます。
核酸塩基の保護基の中では、グアニンのイソブチリル基が外れにくくって、イソブチリル基を切断するために長時間加熱していると分解してしまうような修飾核酸を組み込んでいる場合は、脱保護され易いジメチルホルアミジジル基 (dmf)で保護するのがポピュラーです。

以上がオリゴデオキシリボヌクレオチド(オリゴDNA)のホスホロアミダイト法の反応サイクルです。

ところで、なにも修飾していないないオリゴ核酸は体内でヌクレアーゼ(核酸分解酵素)によってリン酸ジエステル結合が切断されて分解してしうまうことが問題なのですが、核酸を修飾してやるとヌクレアーゼ耐性が向上します。核酸の化学修飾は、リン酸部の修飾、糖部の修飾、塩基部の修飾に分類され、リン酸部の酸素原子(O)を硫黄原子(S)に置換したホスホロチオアート修飾(S化)がよく知られていて、SオリゴとかS化オリゴと呼ばれています。

Sオリゴの合成法は上述したホスホロアミダイト法の酸化反応を硫化反応に変えることで達成されるんですが、ただ一点注意が必要で、キャッピングの前に硫化を行わなければまりません。カップリングが終わったらキャッピングをする前に硫化を行うということです。

というのも、キャッピング反応条件下で三価のリン((P(III))が酸化されるからと言います(このことのが書いてある論文があったら教えてください)。
参考のため硫化剤としてPADSとEDITHを使った場合の反応機構もメモしておきます↓

PADSはピリジンと一緒に使うんですが、効率よく硫化するためのコツがあって、PADSとピリジンをアセトニトリルに溶かして二日以上寝かした(エージングした)試薬を使うと硫化率がアップします。
あと、PADSは水に強いらしくって、1,200 ppmの水を加えて硫化を行なってもリン酸エステル(PO)は副生しないそうです。
Nucleosides, Nucleotides, and Nucleic Acids, 2007, 26:181-199.
Org. Proc. Res. Dev., 2004, 8, 852-858.

ところで、PS型のSオリゴの合成ではキャッピングを硫化の後に行うのが必須ですが、PO型の普通のオリゴの場合はどうなんでしょか?
教科書や殆どの試薬メーカーとかのサイトには、"カップリング→キャッピング→酸化"の順番で記載されているのでこれがゴールデン・スタンダードなのかと思いきや、オリゴヌクレオチド自動合成装置メーカーのYouTube動画では"カップリング→キャッピング→酸化"の順になっています。


PO型の普通のオリゴ核酸合成では、キャッピングと酸化の順番はクリティカルではないのか?それとも、最近では"酸化→キャッピング"の順番にアップデートされているのか?

今度Cytivaの人に会ったら聞いてみようと思う二流大出のテクニシャン(研究補助員)のホスホロアミダイト法メモでした。

2024年1月30日火曜日

Soba_Colle 13 (ソバコレ13)

ども、やっぱりお蕎麦が好きなコンキチです。
新蕎麦が出揃ってこなれてきた時季に攻めたお蕎麦のメモです↓

ENTRY 121   文殊 (visited Dec. 2023)

-たこ唐揚げそば (650 JPY)-
-RATING- ★★★★☆
-REVIEW-
立ち食い蕎麦界屈指のクオリティを誇る文殊の温蕎麦の上に乗った具は、たこの唐揚げ、ほうれん草、玉子、葱と具沢山。
揚げたてでアツアツのたこの唐揚げは、フレッシュ感があり、軟らかくて弾力あって咀嚼感が良いです。気のせいかもだけど、衣に味付いてるような気がしました。



ENTRY 122   翁庵 (上野, visited Dec. 2023)
住所:台東区東上野3-39-8 

-お酒 (550 JPY)- 
-REVIEW- 
熱燗にしてもらったです。 この時季だけど、枝豆がお通しだったです。 


-油揚甘辛煮 (400 JPY)- 
-RATING- 
-REVIEW- 
濃い味の甘辛で酒が進む。お揚げはしんなりソフトタッチ。短冊状に切り出されていて、フグ刺しを食べる様に何枚かまとめてすくって食べるのが良いです。キリッとした味のお醤油も添えられていて味変が楽しめます(味が濃くなるけど)。 あと、ワサビ(ホースラデジッシュメインだと思う)が物凄く良く合う(ワサビ、フレッシュでけっこう美味しい)。 


-ねぎせいろ (850 JPY)-
-RATING- 
-REVIEW- 
蕎麦から立ち昇る芳潤な甘い爽やかな香りに胸がときめく。しなやかで少し角の立った細身の蕎麦の喉越しは最高。そして、僅かに穀物様の旨味。 
つけ汁は甘くしっかり辛い。
具にゲホゾ天も入ってるんだけど、油感はあまり感じず、キリッとした味に仕上がっている。葱美味しいし、丁度いい食感と味わいのゲソがホント美味しい。
リピート必至の旨さ。


ENTRY 123   明神下 蕎麦 おしん (神田明神下, visited Dec. 2023) 
住所:千代田区外神田2-8-2 

-幻鷹 (徳島) 純米吟醸 (720 JPY)- 
-RATING- ★☆
-REVIEW- 
綺麗な吟醸香で桃やミルキーな香味。
サラリとした甘さで後味スッキリ。 
いかにも吟醸といった酒質で美味しい。 
蕎麦味噌はウェットでとろける食感で、高貴な香味。 





-じゃこ胡瓜 (550 JPY)- 
-RATING- 
-REVIEW-
胡瓜の上に焦がしてカリカリになったジャコが振りかけたやつ。
瑞瑞しい胡瓜とパリパリしたジャコの食感と旨さの凝縮したローストフレーバーのマリアージュが凄くいい。 
ジャコは塩味がついてるけど、胡瓜との量とのバランスを考えてお塩をちょい足しして食べるのが良し。 


-瓶ビール (700 JPY)- 
赤星の中瓶。 











-野菜天せいろ (1,750JPY)- 
-RATING- 
-REVIEW- 
お蕎麦からは、なんとも言えないパワフルな香り。派手な香味はないけど、力強い味わい。超極細麺で、それ故、軟らかいんだけど、ちゃんとキックがある。 
ツユは鰹節様の香り強く、シックな味わいながらしっかりとした辛さ。 
そして、蕎麦とツユの相性は感動的で、当然旨いわけ。 
天ぷらは超薄衣。サクッと食感で、油のいい匂い。ちょっぴり甘い匂いもする気がした。
天タネは、ヤングコーン、椎茸、インゲン、蓮根、南瓜、薩摩芋。
お塩は良くすり潰されていて粒子が物凄く細かい。
野菜は全て躍動感を感じる旨さ。中でも南瓜と薩摩芋は秀逸。
南瓜の甘く超絶ふっくらとした食感は新食感。
サツマイモに至ってはウェットでトロリとした舌触りと蕩けるような甘さで完全にスイーツ。


ENTRY 124   言問やぶ (向島, visited Dec. 2023)
住所:墨田区向島1-11-1

-日本酒 (立山 本醸造) (600 JPY)-
-REVIEW-
ぬる燗。
うん。日本酒って感じ。







-鴨南せいろ (1,000 JPY)-
-RATING- ★★★☆☆
-REVIEW-
平打ちの蕎麦からは濃厚な穀物様の甘い香りで、味わいも匂いから想像する通りの甘味。表面がツルッとしていて、少しもっさりとした咀嚼感。
つけ汁は鴨の脂の染み出し感は軽微で、ライトめの味わいもキリッとした辛さがあるが、少し弱いか。全体的に味噌汁っぽい不思議なテイスト。
鴨はソリッドで値段相応な質感も、悪くない。


-日本酒 (金婚 純米酒) (600 JPY)-
-RATING- ★★★★☆
-REVIEW-
冷酒。
甘・辛・酸のバランス良く、普通に美味しい。







-カツ煮 (700 JPY)-
-RATING- ★★★★★
-REVIEW-
安いし特別にいい食材という雰囲気でもないと思うんだけど、調理のレベルが高いからか、相当旨い。
衣の食感とカツの一体感、嫌味のない脂、やや淡白めのカツの味わい、お出汁の味付けの濃淡(塩梅)さとか、調和感がハンパなくって、普通に凄く美味しい。


ENTRY 125   神田まつや (神田須田町, visited Dec. 2023)
住所:千代田区神田須田町1-13


-ビール 大 (935 JPY)-
赤星をセレクト。











-焼鳥 (塩) (990 JPY)-
-RATING- ★★★★★
-REVIEW-
久しぶりに"塩"で食べたけど、やっぱ塩も旨いね。
ふっくらした食感が心地よく、落ち着いた旨味をシンプルに楽しめる。
初めから薄めに塩味がついてるんだけど、追い塩すると味が引き締まります。
あと、レモンと辛子は鉄板の相性。



-冬至そば ゆずきり 大 (1,760 JPY)-
-RATING- ★★★★★
-REVIEW-
神田まつやの冬至の週の風物詩。ゆずきりです。
爽やかな柚子の程よい甘苦な香味が最高。鮮やかな黄色い蕎麦は目も楽しませてくれる。
少しモチッした食感のお蕎麦の啜り心地の素晴らしいこと。
ツユに付けて食べると、柚子の香味がパワーアップ。
今期のゆずきりもとっても美味しかったです。


ENTRY 126   ふかがわ翁 (森下, visited Dec. 2023)
住所:江東区常磐2-12-12 RR tokiwa 1F

-富貴 (燗酒) (800 JPY)-
-RATING- ★★★☆☆
-REVIEW-
とびきり燗(かな)でかなり熱い。
甘味があって、さらっとした辛さ。べたついてなくて普通に美味しい。
うん。燗酒って感じ。


-鴨ざる (数量限定) (1,800 JPY)-
-そばの半量追加 (400 JPY)-
-RATING- 
-REVIEW-
細身の蕎麦からは豊潤な甘い香り。それから少しグラッシー(grassy)。味は無味に近く、吸い付く様なもちっとした食感で喉越しががいい。
つけ汁は甘辛のしっかりボディで、焼いた鴨から滲み出たのであろう焦げたフレーバーと脂感がとても美味しい。
鴨の他の具材は、葱、三ツ葉(だと思う)、柚子皮、キノコ(?)。
鴨(多分、合鴨)はマイルドな味で、肉厚かつ軟らかく均質度が高い。
キノコは不思議な食感。
あと、柚子皮がいいアクセントだったです。



-深川蒸留所クラフトジン FUEKI (1,000 JPY)-
-ソーダ割 (100 JPY)-
-RATING- 
-REVIEW
ジュニパーベリーの深い香味に加えて、爽やかな柑橘の香りがやんわり漂って美味しい。
ボタニカルはジュニパーベリー、パクチー、柑橘類、青紫蘇、生姜、ヒバを使ってるようです。



ENTRY 127   江戸蕎麦手打處 あさだ (浅草橋, visited Dec. 2023)
住所:台東区浅草橋2-29-11

-菊正宗 樽酒 (850 JPY)- 









 

-季節野菜天せいろ (1,600 JPY)- 
-RATING- 
-REVIEW- 
蕎麦からは甘く力強い穀物様の香り。密度が高く少しもっさりした歯触り。
明るい色合いのツユはあっさり系のスレンダーな味わいながら、ちゃんと辛く旨味がある。 
で、蕎麦をツユに付けて啜ると甘みが強まる。
山葵は鄙びた感と爽やか感のあるタイプ。 
天ぷらは、さつまいも、ごぼうチックな野菜、蓮根、舞茸、玉葱、南瓜、椎茸の七品(だったかな)。
油のいい匂いがする薄衣を纏ったお野菜がフレッシュで美味しい。
天つゆで頂くんだけど、個人的には塩で食べたかった。



ENTRY 128   神田 尾張屋本店 (神田須田町, visited Dec. 2023)
住所:千代田区神田須田町1-24-7 

-ビール 大ビン (サッポロ) (770 JPY)- 
黒ラベル。 


-地鶏のやきとり (940 JPY)- 
-RATING- 
-REVIEW- 
甘じょっぱい濃いいタレで、それがいい。
 鶏肉は抑揚のある食感で美味しい。
 酒が進みます。 



-ねぎせいろ (940 JPY)-
-RATING- 
-REVIEW- 
細身喉で越し良くしなやかな食感の蕎麦からは甘いもっさりとした香り。 
つけ汁は甘辛濃いめでいいね。 
烏賊のかき揚げがツユにつかっていて、厚めの衣がツユを吸ってるんだけど、これがなかなか悪くない。
あと、プリっとした淡白な烏賊が濃いツユとマッチして美味しい。


ENTRY 129   日清食品×神田まつや  (31 Dec. 2023)


-鶏南ばんそば (希望小売価格 278 JPY (税別))-
-RATING- 
-REVIEW-
今季で7年目の季節限定ロングセラーカップソバ。
麺、スープ、具のレベルが総じて高いのに加えて、アラフィフのオッサンの胃がもたれない!
前作まではゆず七味の小袋が付いてたんですが、今回から"特製かえし"に変わりました。
ボク的に前の方が良かったですが、何はともあれ年越しそばはこれでキメッ!


ENTRY 130   蕎麦29東京 (東京駅, visited Jan. 2024)
住所:千代田区丸の内1-9-1 東京駅 改札内 八重洲中央口

-肉つけそば (1,000 JPY)-
-RATING- 
-REVIEW-
田舎蕎麦を想わせるフェイスも、蕎麦の香味はあまり感じられず。但し、ボディの強さを感じさせる味わい。角が立っていてしなやかで、喉越しが良く歯切れもいい。
ツユは甘・ピリ辛で、冷やし中華テイストな酸味があって、蕎麦との相性良し。
具材はたっぷりの豚肉と、白髪葱、白胡麻、刻み海苔、刻み葱。
薄切りのお肉のシャワシャワした食感が、蕎麦と一緒に啜るとちょうどいい。
あと、白胡麻の香味が迸っていて、イイネ。
別にお皿に添えられた生卵をぶっかけて混ぜ混ぜすると、神味変!卵由来のテールノートが映えます。
新感覚の蕎麦と思いました。



やっぱ、美味しい蕎麦食うと多幸感でいっぱいになりますね。
ビバ!お蕎麦!


過去のメモはこちら↓